Clostridium beijerinckii DSM 6423 est une souche bactérienne atypique capable de fermenter une variété de substrats et de produire naturellement un mélange de solvants composé d’isopropanol, de butanol et d’éthanol (IBE). Malgré ce potentiel, des limitations subsistent pour son utilisation dans un procédé de synthèse d’isopropanol biosourcé. En particulier, sa faible sélectivité envers cet alcool et sa faible tolérance au mélange de solvants réduisent la quantité de produits récupérables. Ces défauts pourraient être corrigés par des modifications ciblées du génome de cette souche, mais ceci passe par le développement d’outils génétiques, jusqu’à présent inexistants pour cette bactérie, et une meilleure compréhension de son métabolisme. Dans ce contexte, une première thèse réalisée à IFPEN a permis d’établir sa carte génétique et d’isoler de premiers mutants présentant une tolérance accrue à l’isopropanol.Dans la continuité de ces premiers résultats, les travaux de thèse présentés dans ce manuscrit se sont d’abord attachés à développer des outils de génétique ciblée performants. L’utilisation de plasmides Dam- Dcm- a permis pour la première fois de transformer ce microorganisme avec succès, ouvrant la voie au développement d’un outil basé sur la technologie CRISPR-Cas9, qui révolutionne l’ingénierie génétique en modifiant les génomes de manière itérative et sans laisser de trace. Comme preuve de concept, les 2 gènes CIBE_0562 (upp) et CIBE_3859 (catB) ont été inactivés. Cette deuxième modification a rendu ce micro-organisme sensible au thiamphénicol et compatible avec un système CRISPR à deux plasmides développé précédemment à IFPEN pour modifier le génome d’une souche solvantogène de référence, Clostridium acetobutylicum. Après suppression du plasmide endogène pNF2, les efficacités de transformation de la souche ont été drastiquement accrues, nous permettant ainsi d’obtenir une souche plateforme ∆catB ∆pNF2 qui pourra constituer le point de départ de la construction d’une souche performante pour la production d’isopropanol.Parallèlement au développement de ces outils génétiques, ma thèse s’est également consacrée à la caractérisation du microorganisme par plusieurs approches. La première a consisté à déterminer l’impact de différents substrats, modèles ou industriels, sur les performances et le métabolisme de la souche. Après sélection de trois substrats (glucose, saccharose, mélasse de betterave), un procédé de fermentation continue a été mis au point pour isoler les deux états physiologiques caractéristiques d’une fermentation IBE, puis couplé à une analyse multi-omiques. Les résultats préliminaires, s’appuyant sur les données obtenues par protéomique, soulignent l’impact très important de l’utilisation de substrats industriels sur la croissance.Deuxièmement, une approche transcriptomique, le Capp-Switch sequencing, a été employée pour cartographier, à l’échelle du génome, l’ensemble des sites d’initiation de la transcription (TSS) pour la souche DSM 6423 et deux autres souches solvantogènes de référence. Une analyse comparative des TSS a notamment révélé une régulation différentielle de l’opéron de synthèse du butyryl-CoA entre les espèces C. beijerinckii et C. acetobutylicum.Bien que non prévu au début de ce travail, le séquençage d’un mutant obtenu lors de travaux précédents et incapable de produire de l’isopropanol (souche AA), puis la reconstruction de son phénotype dans une souche modèle de C. beijerinckii, a par ailleurs révélé le rôle fondamental du facteur σ54 pour le contrôle des voies de synthèse des solvants et d’assimilation de sucres alternatifs.En conclusion, en approfondissant nos connaissances sur C. beijerinckii DSM 6423 et en permettant des modifications ciblées de son génome, ma thèse s’inscrit dans un ensemble de travaux menés à IFPEN visant à faire de cette souche un organisme modèle pour la fermentation IBE, permettant à terme la bioproduction d’isopropanol à échelle industrielle.